单细胞测序揭示小鼠脊髓小胶质细胞对周围神经损伤的时间及性别特异性反应，并将载脂蛋白E与慢性疼痛联系起来
研究背景
边缘神经损伤常导致神经性疼痛，这是一种与自发性和轻触性疼痛相关的衰弱状态，并伴有脊髓背角小胶质细胞激活和增殖。受损的初级传入神经释放多个分子，如趋化因子(CCL2、CCL21、CXCL1)、信号分子（CSF1）和蛋白酶（MMP-9）来诱导小胶质细胞增殖和激活，其特征是从具有多个精细过程的分支稳态小胶质细胞表型向变形虫样细胞过渡。“激活的”小胶质细胞释放广泛的生物活性物质，向神经元和非神经元细胞发出信号，促进疼痛传递，对疼痛过敏非常重要。小胶质细胞在神经性疼痛的发展和维持阶段发挥重要作用，在周围神经损伤后1-3周可减轻超敏反应。小胶质细胞在神经性疼痛中的作用被认为是性别依赖性的。小胶质细胞增殖和周围神经损伤后的形态变化在雄性与雌性中都存在；然而，小胶质细胞作为神经性疼痛的关键驱动因素的功能作用在雄性动物中被观察到，而在雌性动物中没有。
方法流程
文章主要针对小鼠和人的脊髓样本进行单细胞转录组测序分析。将小鼠雌雄分组后分别进行单侧或双侧SNI手术，并于第3天（急性疼痛发展阶段），第14天（疼痛发展的亚慢性阶段）及第5个月（神经性疼痛的慢性阶段）收集小鼠新鲜脊髓样本并制备单细胞悬液，随后进行流式分选。分选后的细胞采用10X基因组学平台进行scRNA-seq分析；人的脊髓及非脊髓（脑）组织样本单细胞悬液制备好后进行文库制备及高通量测序。分别采集小鼠和人的5456个细胞进行跨物种分析，使用UMAP，Find聚类，RunUMAP函数对集成的数据集进行可视化和聚类。最后，将第3天、第14天及第5个月收集小鼠脊髓样本制备成组织切片进行免疫组化和RNA原位杂交，进而在共聚焦显微镜下分析成像。
本文通过单细胞RNA测序，发现周围神经损伤诱导雄性特异性炎性小胶质细胞亚型的产生，并证明与雌性小鼠相比，雄性小鼠的小胶质细胞增殖增加。还展示了不同小胶质细胞亚群的时间和性别特异性转录变化。载脂蛋白 E (Apoe)是小鼠周围神经损伤后慢性时间点上脊髓小胶质细胞中最高上调的基因。此外，人类APOE基因的多态性与慢性疼痛有关。本文提供了对小鼠和人类脊髓小胶质细胞转录状态的详细分析，并确定了ApoE与人类慢性疼痛之间的联系。
本文最大的特点是采用了sc-RNA、免疫组化及RNA原位杂交等技术手段，从多个角度证明小鼠脊髓小胶质细胞对周围神经损伤的时间及性别特异性反应，并通过共聚焦图像与生物样本库比对确定ApoE与人类慢性疼痛之间的联系。
研究结果
1、神经性疼痛中的小胶质细胞单细胞转录景观
文章通过收集第3天、第14天及第5个月的雌性和雄性小鼠的脊髓样本进行单细胞测序，对获得的188787个细胞进行聚类分析后发现所有的集群中均表达了典型的小胶质细胞基团。
小鼠SNI模型示意图及其脊髓单细胞转录景观图
2、脊髓小胶质细胞转录状态的异质性
基因表达分析确定了在小胶质细胞中簇4、5、6、7、8、10和11唯一表达的基因。这些集群中的细胞在UMAP图中显示出相似性，细胞周期相关标记物Mki67和Top2a在这些小胶质细胞中高表达，但在其他簇中不高表达。但在SNI后3天，雄性小鼠的小胶质细胞数量显著增加（4.9%），而在雌性小鼠中没有（0.03%）(图2a–d)。在SNI检测发生后的第14天和第5个月 ，属于第9簇的小胶质细胞基本未被发现(图2a，c)，显示其神经损伤引起的急性发病和雄性特异性起源。
脊髓小胶质细胞转录状态异质性研究
3、周围神经损伤引起小胶质细胞转录组的深刻的性别特异性变化
为了研究周围神经损伤后小胶质细胞的转录变化，我们在雄性和雌性小鼠的三个时间点鉴定了每个小胶质细胞簇的SNI与相应假手术组中的差异表达基因(DEGs)。小胶质细胞中大量编码核糖体蛋白(小核糖体亚基(Rps)和大核糖体亚基(Rpl))的mrna的表达发生了变化，这种效应雄性比雌雄更明显。为了研究男性和女性小胶质细胞对周围神经损伤反应的差异，我们比较了两性之间的DEGs。在SNI后的第3天，雄性的小胶质细胞比雌性表现出更多的DEGs。在每个时间点，只有一小部分DEGs在性别之间共享。
周围神经损伤引起小胶质细胞转录组的深刻的性别特异性变化
4、ApoE在神经性疼痛的慢性阶段的小胶质细胞中表达
Apoe是两性中第5簇脊髓小胶质细胞中最丰富的转录本。SNI后，雄性和雌性的Apoe mRNA水平在神经损伤后第3天的表达没有变化，但在第14天(雄性：最高上调基因在第1和3组中，在第2、4和6组中显著上调；女性：集群1-6中基因上调最高)和5个月（雄性和雌性集群1-6中基因上调最高）显著上调。脊髓背角中的ApoE蛋白存在于神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞中。与预期的一样，在小胶质细胞中发现了ApoE的免疫反应性细胞质，呈颗粒状，定量了雄性和雌性小鼠SNI后脊髓小胶质细胞中的ApoE，发现ApoE可能在小胶质细胞对周围神经损伤的慢性反应中起作用。
ApoE在神经性疼痛的慢性阶段的小胶质细胞中表达
5、人类APOE基因的多态性与慢性疼痛相关小胶质细胞ApoE的持续上调促使作者研究APOE与人类慢性疼痛之间的联系。APOE的多态性与中枢神经系统的几种慢性疾病有关。文章评估了APOE-ε2和APOE-ε4变异与身体多个部位疼痛报告的相关性，发现APOE多态性与不同的慢性疼痛报告相关。
人类APOE基因的多态性与慢性疼痛相关
结论
本文利用单细胞转录组技术研究了小鼠与人类脊髓小胶质细胞在时间和性别上的特异性反应，并通过免疫组化与原位杂交技术确定了ApoE与人类慢性疼痛的相关性。小胶质细胞从免疫代谢状态到改变代谢状态的转变是神经性慢性疼痛临床相关阶段的一个潜在机制。Apoe的上调与人类慢性疼痛密切相关，该基因上调可能是这种转换的中心机制，进一步的研究可以对神经性疼痛的小胶质细胞依赖机制产生重要的见解。
参考文献
Tansley, S., Uttam, S., Ureña Guzmán, A. et al. Single-cell RNA sequencing reveals time- and sex-specific responses of mouse spinal cord microglia to peripheral nerve injury and links ApoE to chronic pain. Nat Commun 13, 843 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-28473-8
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